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Proteinfraktionierung

Um die einzelnen Proteine eines Organells zu isolieren verwendet man in der Regel chromatografische Methoden.

Bei der Säulenchromatografie wird eine Lösung mit Proteinen über eine Säule mit einer porösen, festen Matrix geschickt. Durch Interaktion der Proteine mit der Matrix werden die Proteine unterschiedlich zurückgehalten und gemäss ihrer Grösse, Ladung, Hydrophobie oder Bindungseigenschaften aufgetrennt.

Bei der Affinitätschromatografie wird ein Enzymgemisch nach seiner Wechselwirkung zu einem Substrat aufgetrennt. Dabei ist das Substrat an die Säule gebunden und man lässt das Gemisch darüber laufen. Auf ähnliche Weise kann mit komplenemtärer DNA auch nach DNA-Fragmenten suchen.

Bei der HPLC, der Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatografie wird eine sehr gute Auflösung erreicht, indem an Steller einer Matrix ein homogenes Säulenbett verwendet wird. Durch dieses Säulenbett wird das zu trennende Gemisch mit einem hohen Druck gepresst und auf Grund der hohen Dichte der Packung in sehr kurzer Zeit aufgetrennt.

Die Grösse eines Proteins wird normalerweise mit dem sogenannten SDS-PAGE, einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Bei diesem Verfahren werden die Proteine zunächst mit einer reduzierenden Substanz behandelt, die die S-S-Brücken und damit die Untereinheiten trennt, und dann mit einem Detergenz (SDS) behandelt, dass an die hydrophoben Bereiche bindet und die Proteine so mit einer negativen Ladung versieht. Diese Proteine werden an dem Gel aufgetragen und bewegen sich auf Grund ihrer Ladung in Richtung einer positiven Elektrode.

Die nach ihrer Grösse aufgetrennten Proteine können gefärbt und dann auswegertet werden.

Bei dieser Methode können sich allerdings Banden überlagern und die Genauigkeit ist nicht sonderlich hoch. Benutzt man jedoch ein zweidimensionales Verfahren, das die Proteine auf Grund ihrer Ladung und ihrer Grösse trennt, erreicht man wesentlich besssere Resultate.

Hierbei werden die Proteine zunächst entsprechend ihrem isoelektrischen Punktes aufgetrennt und dann in einem zweiten Schritt entlang einer senkrecht zur bisherigen Ebene verlaufenden Trennungsebene aufgetrennt. So erhält man eine zweidimensionale Proteinkarte.

Um in einem Gel ein bestimmtes Protein nachzuweisen, verwendet man das Western-Blotting. Hierbei wird ein Gel mittels eine elektrischen Felds auf einer Cellulosemembran aufgebracht. Auf dieser kann man das Protein mit einem spezifischen Antikörper nachweisen.

Schneidet man ein Protein mit sequenzspezifischen Peptidasen, so erhält man eine Mischung von kleinen Peptidfragmenten, die man mittels Chromatorgrafie zu einer Peptidkarte trennen kann. Mittels solcher Karten kann man zum Beispiel defekte Proteine (Sichelzellenanämie) identifizieren.

Die genaue Squenz kann man mit einem automatischen Verfahren durch sequentielles Abspalten der einzelnen Aminosäuren analysiert werden. Aus diesen Informationen kann man dann eine DNA-Sonde herstellen, mit der man dann die DNA-Sequenz ,,fischen``  kann.

Um die dreidimensionale Struktur eines Proteins vorherzusagen benötigt man die Röntgen-Kristallstrukturanalyse. Lenkt man einen konzentrierten Röntgenstrahl auf eine reine, kristallisierte Probe eines Proteins, so werden die meisten Strahlen die Probe passieren; einige werden jedoch gestreut und können auf einem Detektor als Beugungmuster sichtbar gemacht werden.

Eine andere Methode ist die Kernresonanzspektroskopie (NMR). Bei diesem Verfahren benötigt man keine kristalline Probe, sondern nur eine konzentrierte Lösung des Proteins.

Das Verfahren beruht darauf, dass man den Spin eines Atoms mit einem starken Magnetfeld ausrichtet; wenn er dann wieder in seinen Grundzustand zurückkehrt, emmitiert er eine messbare Radiostrahlung.

Bei der zweidimensionalen NMR misst man die charakteristische Frequenz und Intensität der Wasserstoffe eines Aminosäurerestes und dessen Beeinflussung durch andere Gruppen. So kann man eine dreidimensionale Verteilung der Aminosäuren rekonstruiern.


 
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